溶液内蛋白质鉴定

　　（1）背景介绍

　　溶液内蛋白质鉴定的基本流程与胶内蛋白质鉴定类似，主要区别在于：（1）溶液内蛋白质样品处理方法有别于胶内样品；（2）溶液内蛋白成分较单一蛋白条带相对复杂，需采用较长的梯度进行质谱数据采集。

　　根据项目的不同，样品可能是复杂的全细胞裂解液，或者IP的洗脱液，或者蛋白纯化产物，通过质谱检测，可以得到样品中蛋白成分的鉴定结果，并可根据特定需求，提供相对定量参考或蛋白功能注释等分析。

 

　　（2）实验流程

 

 

　　（3）案例分析

　　a.目的

　　鉴定与靶标蛋白DDX58相互作用的蛋白质。为了实现这一目标，选取两种细胞系（一种为稳定表达带HA标签DDX58蛋白的293细胞系，命名为实验组T；另一种为常规293细胞系，命名为对照组C），用HA抗体分别免疫共沉淀实验组T及对照组C，收集蛋白洗脱液，溶液内酶解后，通过质谱分析，排除非特异性结合蛋白，最终筛选出与DDX58相互作用的蛋白。

 

　　b.步骤

　　1）免疫共沉淀纯化靶标蛋白及相互作用蛋白；

　　2）从洗脱液中进行蛋白提取；

　　3）溶液内蛋白酶解；

　　4）质谱检测；

　　5）数据库检索并鉴定蛋白。

 

　　c.结果

　　在实验组T和对照组C中鉴定到的蛋白可以分为两大类：一类是在T组含量比在C组多的蛋白，另一类则是含量相当或在C组更多的蛋白。根据实验目的，需要关注的蛋白是第一类，作为互作的候选蛋白。部分鉴定结果如下表所示，靶标蛋白DDX58只在实验组T中被检测到，ACTN4、SFPQ、SND1则可能是DDX58的相互作用蛋白。基于蛋白质丰度越高，采集到的二级谱图数越多的原则，我们采用谱图计数方法进行蛋白含量相对比较，结果见下表：

 

　　质谱鉴定蛋白列表